Principy imunoanalytických metod

Planární mikroarraye – proteinové čipy

Proteinové čipy se vyvinuly z technologií připravených původně pro analýzu DNA. Protilátky nebo antigeny jsou naspotovány na planární povrch – silikonových čipů nebo skleněných sklíček s nitrocelulózovou membránou (FAST slides). Čipy jsou tedy prostorově uspořádané reagencie na pevném povrchu, v připadě imunoanalýzy obsahuje každá oblast neboli spot definovanou protilátku (antibody microarrays) nebo antigen. Přesná pozice (spot) specifické protilátky/antigenu na čipu definuje typ analytu, který je stanovován. Studované proteiny jsou kvantifikovány díky různým principům vytvářejícím signál a jeho zesílením – kolorimetricky, radioaktivitou, fluorescencí, chemiluminiscencí, enzymovými reakcemi atd. – a intenzita signálu je měřena určeným typem scanneru nebo kamery. Vyhodnocení vyžaduje speciální software, který vyhodnotí intenzitu signálu v daném spotu a porovná ji s kalibrační křivkou, pozitivní a negativní kontrolou popř. alespoň s ostatními spoty na čipu.

Čipové technologie můžou být rozděleny podle jejich filozofie přístupu:

• přímé technologie (forward phase arrays),
• reverzní technologie
• čipy pro studium proteinových interakcí.

Na čipech přímé technologie je inkubován vždy jeden vzorek na čipu, takže může být současně stanoveno větší množství proteinů. Na reverzních čipech je imobilizováno větší množství různých vzorků. V jednom kroku tak může být stanoven jeden konkrétní protein ve velkém množství vzorků zároveň. Tato technika je také používána s malými kousky tkání nebo kousků tkání získaných mikrodisekcí.

Obrázek 23. Protilátkové mikroarraye

Arraye na mikrotitračních destičkách

Jsou přímou modifikací ELISové technologie. V každé jamce destičky je na dně naspotováno až několik specifických protilátek, které vyváží sledované proteiny ze vzorku proteiny a na principu sandwichové reakce je umožněna chemiluminiscenční nebo fluorescenční detekce. Zástupcem je např. Thermo Scientific SearchLight Protein Array technologie, která umožňuje z 50 µl vzorku zachytit až 16 různých analytů, které jsou detekovány přidáním biotinylované protilátky, následované přidáním křenové peroxidázy a chemiluminiscenčního substrátu. Produkce světla je detekována CCD kamerou a analyzována pro každý spot speciálním softwarem. (www.piercenet.com/products; Moody M.D., 2001).