Principy imunoanalytických metod

ZÁKLADNÍ POJMY A PRINCIPY IMUNOANALÝZY

Autoři: Kristián Šafarčík, Vladimír Bartoš, Marie Karlíková

Využití imunochemické reakce protilátka-antigen in vitro je základem metod klinické diagnostiky i výzkumu, které slouží ke kvantifikaci molekul v biologických tekutinách, extraktech tkání či supernatantech buněčných kultur. Mimořádně vysoká citlivost imunoanalytických metod (detekční limity dosahují hodnot 10^-25 až 10^-20 mol.L^-1, což v praxi znamená koncentraci přibližně jedné molekuly na litr) souvisí s přirozenou reaktivitou protilátek, zejména s jejich vlastnostmi:

1/ schopností vázat se na široké množství přirozených i umělých sloučenin, buněk i virů, které se chovají jako antigeny (protilátky jsou proteinového charakteru a jejich velké množství vazebných míst je odvozeno z obrovského počtu kombinací sekvencí aminokyselin),

2/ specifitou pro reagující látku, tj. schopnost vázat se právě na tuto látku za přítomnosti dalších sloučenin,

3/ silou vazby protilátky s antigenem, takže komplex protilátky-antigen zůstane stabilní i během různých, např. separačních procesů.

Pro detekci a kvantitativní vyjádření výsledku je nezbytné, aby jeden z účastníků reakce (buď protilátka, nebo antigen) byl značený indikátorem, který lze jednoduše měřit s vysokou přesností a reprodukovatelností. Indikátorem může být radioaktivní izotop (radioizotopové metody) nebo jiná látka: enzym, fluorescenční látka, DNA, koloidní částice a pod. (neradioizotopové metody). Více viz kapitola Indikátory u imunoanalytických metod.

Moderní imunoanalytické metody jsou snadno proveditelné a dobře automatizovatelné. Uplatňují se v mnoha odvětvích lékařství i biomedicínského výzkumu. Využívají se zejména ke stanovení látek s velmi nízkou koncentrací, např. hormonů, nádorových markerů, cytokinů apod., ale i imunoglobulinů, virů, léků a mnoha dalších molekul.

Počátky imunoanalýzy

V 50. letech 20. století fyzikové Rosalyn Yalowová a Solomon Berson (pracovní i životní partneři) popsali princip radioimunoanalýzy (RIA), s jejíž pomocí změřili do té doby nedetekovatelná množství inzulinu v krvi. Yalowové a Bersonovi bylo jasné, že obdobné metody, založené na soutěži značeného a neznačeného antigenu o vazebná místa, bude možné vypracovat i pro další analyty, a tuto možnost chtěli poskytnout celému světu. Proto své poznatky uveřejnili bez patentové ochrany. V roce 1977 obdržela Yalowová (Berson se toho již nedožil) Nobelovu cenu za vývoj radioimunoanalýzy pro peptidové hormony. Později se hledaly i jiné možnosti značení molekul tak, aby byla umožněna stejně citlivá detekce. V roce 1971 se objevily metody, které místo radioizotopů využívaly enzymy. Jejich autory byli Eva Engvallová s Peterem Perlmanem ze Švédska a Bauke van Veemen s Antonem Schuursem z Holandska. Zatímco Holanďané svůj systém patentovali, Engvallová a Perlman věnovali světu metodu ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) stejně velkoryse, jako to před nimi s RIA udělali R. Yalowová a S. Berson. (převzato z Lapčík 2009).