Principy imunoanalytických metod

Standardem se obecně rozumí určovaná látka (analyt) s deklarovanou koncentrací.
Musí jít o čistý, homogenní, stabilní preparát analyzované látky, který má v ideálním případě definovanou strukturu a molekulovou hmotnost. Tato podmínka však v mnoha případech v praxi nemůže být splněna. Lze proto hovořit o dvou skupinách standardů v závislosti na vlastnostech látek, ze kterých jsou připravovány a pro jejichž stanovení jsou používány.

Do první skupiny patří látky se známým složením (tím i strukturou a molekulovou hmotností), které mohou být produkovány chemickou syntézou s velmi vysokou čistotou (99,9%). Příkladem mohou být jednodušší biologicky aktivní látky, jako jsou steroidy, thyreoidální hormony nebo léky, které jsou komerčně dostupné v čisté formě. Tyto látky mohou sloužit pro i přípravu primárních standardů nejvyšší metrologické kvality. Pracovní roztoky standardů (kalibrátory pro měřicí metodu) je možno připravit rozpuštěním přesné navážky standardu v přesně známém objemu vhodného rozpouštědla.

Do druhé skupiny patří látky, jejichž struktura naopak není úplně jednoznačně definovatelná. Tyto látky není možné připravit chemickou syntézou a získávají se tak jinými postupy, například izolací z biologických materiálů, často s obtížným zajištěním reprodukovatelnosti výsledku. U těchto preparátů mohou nastávat problémy s homogenitou, znečištěním látkami s příbuznými vlastnostmi, prekursory a metabolity. Takovéto látky nemohou být dostatečně definovány chemickými a fyzikálními metodami, takže u nich není možné zajistit návaznost na jednotku SI a pro numerické vyjadřování velikosti odpovídajících veličin jsou pak používány mezinárodně dohodnuté jednotky (IU). Tak je tomu např. u řady složitějších biologicky aktivních látek jako například proteinových či peptidických hormonů, nádorových markerů bílkovinné povahy apod. Ze skutečnosti, že se v těchto případech nejedná o adekvátně definované analyty pak vyplývá i fakt, že pravá hodnota měřené veličiny je v těchto případech tudíž reálně neznámá.

Z hlediska použití standardu v imunoanalytické metodě je rovněž nutným požadavkem, aby se jednalo o preparát, který je v maximální míře imunochemicky shodný s určovanou látkou.

Pro analyty, které bývají stanovovány imunoanalytickými metodami, jsou referenční metody a primární referenční materiály zatím dostupné pro měření koncentrací velmi omezeného počtu látek nepeptidické povahy, jako jsou například:

• celkový tyroxin (T4 celkový)
• aldosteron
• testosteron
• 17-β-estradiol
• progesteron
• kortizol

Pouze u těchto látek tak existuje předpoklad pro zajištění návaznosti jejich měření
až na jednotku SI. V ostatních případech (bez takovéto návaznosti) nelze dosáhnout dostatečné míry jednotnosti a vzájemné porovnatelnosti výsledků měření. I když byly pro některé z těchto látek připraveny a schváleny mezinárodní referenční materiály, není tato skutečnost vzhledem k charakteru analytu automatickým předpokladem zajištění vzájemné porovnatelnosti výsledků měření.

Vedle problémů spojených jednoznačným definováním stanovovaného analytu jako chemického individua existují rovněž problémy spojené s přípravou vhodných pracovních kalibrátorů a kontrolních materiálů a s jejich komutabilitou, projevující se například rozdílnou imunoreaktivitou referenčních materiálů nebo kalibrátorů a měřených nativních vzorků.

Kalibrační materiály jsou často připravovány izolací z produkčních žláz a tkání a nejsou například glykosylovány, zatímco zkoušené biologické materiály ano. Purifikace analytů po jejich izolaci může vést k částečné nekontrolovatelné degradaci. I látky připravované rekombinantními technikami, "pozměňují" často svoji strukturu, a v důsledku toho se zvyšuje pravděpodobnost výrazných vlivů matrice.

Významnou roli pro zhoršenou porovnatelnost výsledků imunoanalytických metod sehrávají rovněž skutečnosti vyplývající z přímé podstaty imunochemické reakce, tedy vazby specifické protilátky a antigenu, ovlivněné nejen charakterem stanovovaného analytu, ale i vlastnostmi použitých protilátek. Ovlivňujícími faktory mohou být například:

• orientace protilátek k epitopům, nacházejícím se v málo stabilních oblastech proteinových molekul, například v oblastech podléhajících proteolýze v podmínkách in-vitro,
• orientace protilátek k oblastem, které nejsou nositeli specifických fyziologických vlastností molekul (hCG, TSH)
• používání protilátek, které nejsou schopné reflektovat různý stupeň glykosylace, ale i syalilace, sulfatace, degradace či agregace imunochemických analytů
• různá úroveň glykosylace často typická pro specifické chorobné stavy a projevující se často také přítomností různých izoforem imunochemického analytu (použité analytické systémy nejsou obvykle schopné postihnout ani základní poměr jednotlivých izoforem).

Konečně průběh imunochemické reakce může být poměrně zásadním způsobem ovlivněn také samotnými reakčními podmínkami, jako jsou například pH, iontové síly, přítomnost detergentů apod. Tyto vlivy nejsou někdy dostatečně známy a respektovány.

Ve svém důsledku jsou uvedené skutečnosti důvodem vysoké závislosti výsledků imunochemických měření na použitém analytickém systému (kombinace použitých protilátek, podmínky imunochemické reakce apod.). Z hlediska praktické aplikace tak u těchto metod neexistují předpoklady pro obecně akceptovatelné jednotné hodnoty referenčních intervalů a diagnostických rozhodovacích limitů.