Principy imunoanalytických metod

Mikrokuličky jsou velmi zajímavou alternativou k planárnímu uspořádání čipů. Používají detekci průtokovou cytometrií a jsou vhodné především pro projekty, kde je již studováno měnší množství proteinů – tedy pro studie více cílené než studie na proteinových čipech. Výstupem těchto stanovení je skutečně kvantitativní určení koncentrace proteinu, na rozdíl od čipů, kde jsou výsledky často pouze kvalitativní nebo semikvantitativní.

Technologie FlowCytomix

Technologie Flow Cytomix je založena na sadě mikrokuliček o dvou velikostech (4 μm & 5 μm). Každá ze dvou velikostí mikrokuliček je dále rozlišena různými intenzitami fluorescenčního barviva. Na každé sadě mikrokuliček je navázána specifická protilátka, druhá protilátka je značená fykoerytrinem. Měření probíhá na běžném průtokovém cytometru a data se vyhodnocují speciálním programem. Toto uspořádání umožňuje stanovit zároveň koncentrace 20 analytů.

Technologie xMAP

Multi-analyte profiling technologie (xMAP) je založena na sadě 5,6 μm polystyrenových mikrokuliček. V této sadě je 100 populací mikrokuliček, které se liší vnitřním spektrálním kódem vytvořeným kombinací dvou fluorescenčních barviv v různém poměru. Multiplexová analýza je založena na specifických protilátkách navázaných na jednotlivé populace mikrokuliček. Protože jsou mikrokuličky rozlišené spektrálním kódem můžou být kombinovány v analýze a umožnují tak stanovení teoreticky až 100 analytů v jedné reakční jamce. Množství stanovovaného proteinu je určeno na základě druhé protilátky značené fluorescenční molekulou. Reakce tedy probíhá na principu sendviče.

Obrázek 24. Rozlišení mikrokuliček pro xMAP technology (zdroj: www.panomics.com)

 Měření probíhá na speciálním průtokovém cytometru - přístroj Luminex. Mikrokuličky z reakční jamky jsou nasáty do přístroje, kde protékají v nosném proudu jedna za druhou mezi dvěmi lasery. Fluorescenční signál po excitaci prvním laserem určuje spektrální kód kuličky – tedy druh měřeného analytu – a fluorescenční signál po excitaci druhým laserem určuje množství druhé protilátky, tedy množství analytu.

Obrázek 25. Princip xMAP měření ( zdroj obrázku www.panomics.com)

 Pro imunochemickou reakci se používají mikrodestičky s filtračním dnem. Nenavázané látky se z reakce odmývají dnem destičky přes filtry, které udržují mikrokuličky s navázanými proteiny v jamce. Koncentrace jednotlivých analytů je vypočtena na základě kalibračních křivek zkonstruovaných pro každý měřený protein.

Všechny další imunoanalytické přístupy jsou také použitelné  na xMAP platformě např. kompetitivní imunoanalýza, receptor-ligandová analýza nebo pro stanovení protilátek antigen navázaný na mikrokuličky. Kromě imunoanalytických stanovení umožňuje tato platforma také analýzu DNA nebo RNA molekul, které jsou přímo nebo po jejich amplifikaci multiplexově detekovány specifickými sondami vázanými na mikrokuličky.

Obrázek 26.  Protilátky navázané na mikrokuličky s vyvázanými proteiny ze vzorku a po přidání značené druhé protilátky  (zdroj obrázku www.rndsystems.com)

 Obrázek 27. Příklad z měření  xMAP technologií – Multiplexová analýza 10 cytokinů

Obrázek 28. Kalibrační křivky pro 13-plex panel lidských hormonů (Zdroj: http://www.biotek.com/resources/articles/workflows-luminex-xmap-assays.html)

xMAP je otevřená technologie a v současnosti lze nakoupit reagencie pro imunoanalýzu od mnoha světových výrobců. Bohužel pro společné stanovení nelze kombinovat látky, které mají velmi odlišné biologické koncentrace, pokud jejich protilátky vykazují zkříženou reaktivitu a pokud mají příliš rozdílné požadavky na preanalytickou fázi.

Obrázek 29. Přístroj Luminex 100 (zdroj: www.luminexcorp.com)

 Obrázek 30. Princip přímé kvantifikace RNA na multiplexovém principu na Luminexové platformě (zdroj obrázku -www.panomics.com)

V současnosti jsou již k dispozici reangencie pro Luminexovou platformu obsahující magnetické mikrokuličky (MagPlex®), což umožňuje jednodušší separaci během reakčních kroků a především jejich automatizaci na jednoduchých promývacích stanicích nebo jako součást pipetovacích automatů.

FlexMAP technologie jako další generace multiplexových přístrojů od fy. Luminex umožňuje přidáním třetí rozlišovací barvy do mikrokuliček měření až 500 analytů zároveň v jedné analýze, což při použití 96-jamkové mikrotitrační destičky znamená možnost až  64000 testů za 45 minut.

Zcela novým konceptem od fy. Luminex je přístroj MAGPIX. Ten umožní měření až 50 testů současně v jednom reakčním objemu a měření na tomto přístroji je založeno na principu  CCD zobrazovací technologie na rozdíl od přístrojů řady Luminex xMAP.