Principy imunoanalytických metod

V případě kompetitivních metod je specifická protilátka (Ab) v reakci přítomna v omezeném množství. O její vazebná místa soutěží (kompetují) značený antigen (Ag*) v nadbytku a stejný, avšak neznačený antigen (Ag), který je přítomen v analyzovaném vzorku a jehož množství stanovujeme. Dochází k saturaci vazebných míst protilátky oběma antigeny:

Ag + Ag* +  Ab            Ag-Ab + Ag* Ab + Ag + Ag*

Graficky je kompetitivní imunoanalýza znázorněna na Obrázku 4.

Obrázek 4. Princip kompetitivní radioimunoanalýzy (převzato z www.zdn.cz).

Při praktickém provádění této metody se do všech reakčních zkumavek pipetují konstantní množství protilátky a značeného antigenu; množství antigenu je vždy větší než množství protilátky. Množství protilátky je proto nedostačující k navázání všech přítomných molekul antigenů. Výsledkem reakce je vznik dvou imunokomplexů, neznačeného (Ag-Ab) a značeného (Ag*-Ab). V reakční směsi zůstávají i antigeny nenavázané (Ag*, Ag), tj.volné. V rovnovážném stavu reakční směsi je množství vznikajícího značeného komplexu (Ag*-Ab) nepřímo úměrné množství přítomného neznačeného antigenu (Ag). Podíl značeného antigenu (indikátoru), vázaného na protilátku (množství značeného komplexu Ag*-Ab), se obvykle označuje jako vázaná frakce (B - “bound”). Jako volná frakce (F - “free”) se označuje množství nevázaného indikátoru Ag*. Pro kvantitativní vyhodnocení je nutná vzájemná separace obou frakcí, která se provádí různými fyzikálně-chemickými postupy. Po jejich oddělení je nutné změřit odezvu alespoň jedné z frakcí. Podle druhu použitého indikátoru je měřenou odezvou radioaktivita, absorbance, fluorescence, luminiscence apod.

Na základě analýzy kalibrátorů lze pak znázornit grafickou závislost měřené odezvy (např. poměrů B/F - osa y) na koncentraci antigenu (osa x) a tak sestrojit kalibrační závislost (Obrázek 5). V případě kompetitivních metod získáme v lineárních souřadnicích křivku ve tvaru hyperboly. Jestliže se za stejných podmínek jako kalibrátory analyzuje vzorek s neznámým obsahem antigenu, pak lze určit z kalibrační závislosti jeho koncentraci.

Obrázek 5 Charakteristické kalibrační závislosti u kompetitivních a nekompetitivních metod

Kompetitivní metody jsou základem nejstarší imunoanalytické metody, radioimunoanalýzy (RIA).