Principy imunoanalytických metod

Základní principy uplatňované u fluorescenční imunoanalýzy (FIA) jsou modifikací těch, které byly zmíněny v obecné části o imunoanalytických metodách.

Fluorescence a její detekce

Fluorescence je fyzikální jev, kdy látka - fluorofor - je schopna absorbovat energii dodávanou ve formě elektromagnetického záření, (tzv. excitační záření), a následně vyzařovat elektromagnetické záření o jiné vlnové délce (emisní záření). Energetická spektra excitačního i emisního záření úzce souvisí se základní strukturou látky, přičemž emisní spektrum je posunuto do oblasti vyšších vlnových délek než spektrum excitační. Fotony absorbované souborem molekul jsou totiž z části degradovány na tepelnou energii, z části jsou vyslány jako fotony o nižší energii (vyšší vlnové délce), než jakou měl foton původní. Rozdíl maxim excitačního a emisního fluorescenčního spektra se nazývá Stokesův posun. Podíl počtu emitovaných fotonů k počtu fotonů absorbovaných se nazývá kvantový výtěžek fluorescence ( n ) a může nabývat hodnot 0 a1.

Požadavky na fluorescenční indikátor vhodný pro použití ve FIA lze shrnout do tří podmínek:

• vysoká molární absorbance
• vysoký kvantový výtěžek
• velký Stokesův posun

Nejužívanějším fluorescenčním indikátorem je fluorescein. Exitační maximum má při 490 nm a emisní maximum při 520 nm. Některé sérové komponenty, (např. albumin-bilirubinový komplex), při těchto vlnových délkách interferují. Interference při měření biologických materiálů se mohou silně projevovat také rozptylem záření nebo jeho zhášením. Proto je měření fluorescence silně ovlivňováno prostředím, ve kterém se provádí. Klasická fluorescence vykazuje po krátkém excitačním osvitu určitou dobu dosvitu fluorescenčního signálu, která je rozdílná pro různé látky. Tento fluorescenční dosvit se u látek běžně vyskytujících v séru pohybuje v rozmezí 1 – 20 ns. U běžně používaných fluorescenčních indikátorů se pohybuje rovněž v řádu nanosekund (fluorescein 4,6 ns). Emisní spektra z různých fluorescenčních zdrojů séra tak mohou interferovat s emisním spektrem indikátoru nejen vzhledem k podobné vlnové délce svých píků, ale překrývají se rovněž časově a nedají se prakticky rozlišit.

Zcela zásadní přínos pro měření fluorescence má technika zvaná časově modulovaná detekce fluorescence (“time resolved fluorescence measurement“ - TR fluorescence), založená na použití nových fluorescenčních indikátorů - lanthanidových chelátů - zejména europia, samaria, terbia nebo thulia (Obrázek 2.6).

Obrázek 20. TR-fluorescence - časový průběh měření

Jejich zavedením se podařilo překonat problém fluorescenčního pozadí média, ve kterém se fluorescence měří. Jedná se o indikátory s velmi dlouhou fluorescencí, přičemž její detekce je časově modulovaná. Krátký světelný impuls ze světelného zdroje (xenonové výbojky) nebo pulzního laseru slouží jako excitační zdroj a fluorescence je pak měřena s určitým časovým odstupem.

Dosvit fluorescenčního indikátoru na bázi chelátů vzácných zemin je mezi 10 – 1000 µs. Excitační spektrum má velmi široký pík, emisní pík pak velmi úzký. Navíc Stokesův posun proti běžným fluorescenčním indikátorům je mnohem větší, pík emisního spektra je posunut až do červené oblasti viditelného spektra. Měření fluorescence, po časové prodlevě v intervalu 400 až 800 µs po osvitu, oddělí parazitní fluorescenci sérových komponent, které mají podstatně kratší dosvit. Excitační osvit se opakuje tisíckrát za sekundu. Problematikou TR fluorescence a její aplikací v imunoanalýze s využitím lantanidových chelátů jako indikátorů se velmi široce zabývala firma Wallac (ve spojení s firmami LKB a Pharmacia). Byl vyvinut imunoanalytický systém DELFIA, později využitý i u automatického analyzátoru AutoDELFIA. Tímto systémem ke možno v běžné reakční směsi detekovat koncentrace 10 ^-17 mol.L^-1 Eu³⁺, což vysoce převyšuje detekční mez běžných fluorescenčních měření bez časové modulace (10^-11 - 10 ^-12 mol.l ^-1).

Jedním z příkladů této realizace imunoanalytických metod je Fluorescence Polarization Immunoassay – FPIA. Tato kvantitativní analytická metoda využívá kombinace dvou principů - kompetitivní imunochemické reakce mezi stanovovaným analytem a vhodným indikátorem o vazebná místa na specifické protilátce a měření vertikálně polarizovaného fluorescenčního záření emitovaného po excitaci vzorku rovněž polarizovaným světlem.

Tato technologie je použitelná pro určení koncentrace malých molekul.

V kompetitivním uspořádání metoda poskytuje možnost stanovit koncentrace analytu bez nutnosti separace volné a vázané frakce fluorescenčního indikátoru. Postup byl vyvinut firmou Abbott a byl využíván v přístrojích TDx, IMx nebo AxSYM, které jsou používány pouze ojediněle.

Homogenní fluorescenční imunoanalýza

Mezi nejpokročilejší technologie homogenní imunoanalýzy patří technologie TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) vyvinutá firmou CIS (Obrázek 21). Jako fluorescenční indikátory se používají kryptáty vzácných zemin, které vykazují dlouhotrvající fluorescenci v řádu 10 - 1000 µs, což umožňuje použití časově modulované detekce fluorescence.

Obrázek 21. Metoda TRACE

Pro praktické provádění imunoanalýz využívajících tento originální princip homogenní FIA byl vyvinut analyzátor KRYPTOR dodávaný nyní firmou B.R.A.H.M.S.