Vitamin D je neaktivním prekursorem biologicky
účinného 1 a,25–dihydroxyvitaminu
D (1 a,25(OH)2D),
který spolu s parathormonem a kalcitoninem řídí homeostázu vápníku. Rozeznáváme
2 formy vitaminu D, tj. cholekalciferol (vitamin D3) a ergokalciferol (vitamin
D2). Hlavním zdrojem vitaminu D3 je jeho endogenní biosyntéza z prekursoru
7-dehydrocholestrolu, u kterého je fotolyticky po exposici plasmatické membrány
keranocytů v kůži slunečním světlem o vlnových délkách 280-320 nm otevřen kruh
B. Z tohoto provitaminu D3 vzniká spontánní isomerizací cholekalciferol.
Prekursorem vitaminu D2, který si neumí lidský organismus sám syntetizovat, je
ergosterol, který je obsažen například v houbách. Biosyntéza ergokalciferolu
potom probíhá identicky jako u vitaminu D3.
Z hlediska biologické funkce je otázkou, zda je vitamin D2 rovnocenný s
vitaminem D3. Oba druhy vitaminu D, tj. D2 a D3, se od sebe liší v postranním
řetězci molekuly na 17 b-pozici sekosteroidu (vitamin D2 má jednu dvojnou
vazbu a jednu methylovou skupinu navíc), jejich další metabolická cesta je ale
stejná, tj. pomocí hydroxyláz patřících do rodiny cytochrom-P450 enzymů nejprve
probíhá hydroxylace vitaminu D v poloze C25 prostřednictvím v játrech
produkované 25-hydroxylázy za vzniku kalcidiolu, tj. 25-hydroxyvitaminu D
(25(OH)D), který odráží míru zásobení organismu vitaminem D z exogenních i
endogenních zdrojů. Biologicky aktivní, hormonálně účinný kalcitriol (1 a,25-dihydroxyvitamin
D, 1 a,25(OH)2D)
vzniká v ledvinách účinkem 1 a-hydroxylázy, která je hormonálně regulovaná (PTH
ji stimuluje, naopak 1 a,25(OH)2D inhibuje). V ledvinách, ale i v dalších
tkáních, se vyskytuje enzym 24-hydroxylasa, která katalyzuje syntézu
24,25(OH)2D z 25(OH)D, především však inaktivuje 1 a,25(OH)2D jeho přeměnou na
biologicky neúčinný 1 a,24,25(OH)3D. 1 a,25(OH)2D
se podílí na vlastní inaktivaci tím, že stimuluje expresi
24-hydroxylázy. C3-epiméry vitaminu D lišící se konfigurací hydroxylu na C3
mají v porovnání s nativními metabolity jen přibližně 20% biologickou aktivitu,
ale jsou charakteristické pro první rok života, kdy je u novorozenců v
cirkulaci nacházeno více než 50 % kalcidiolu ve formě C3-epiméru.
1 a,25(OH)2D
realizuje svoji biologickou funkci interakcí s jaderným receptorem
specifickým pro vitamin D (VDR), ale i negenomicky interakcí s membránovými
receptory cílových buněk. Ledviny jsou téměř výlučným zdrojem cirkulujícího 1 a,25(OH)2D,
ale i řada dalších buněk a tkání exprimuje 1 a-hydroxylázu a mohou tak lokálně
auto- či parakrinním mechanismem vytvářet 1 a,25(OH)2D. Vitamin D je klíčovým
regulátorem homeostázy kalcia a fosforu ve smyslu absorpce střevního kalcia a
fosfátů, reabsorbce Ca a P v ledvinách a mobilizace Ca, P z kosti, ale má také
významné extraskeletární biologické účinky, kdy působí v organismu
antiproliferativně, prodiferenciačně, proapopticky a imunomodulačně (suprimuje
humorální odezvu, aktivuje vrozenou celulární odezvy). Dlouhodobý nedostatek
vitaminu D, a z něho vyplývající snížení hladiny 1 a,25(OH)2D způsobuje křivici u
dětí a osteomalácii u dospělých. Spolu s nedostatkem kalcia a dalšími změnami
souvisejícími se vzrůstajícím věkem se podílí i na osteoporóze, alopecii,
slábnutí svalů, vývoji sekundárního hyperparathyroidismu u pacientů s
chronickou renální nedostatečností, a současný výzkum naznačuje i jeho spojení
se zvýšeným krevním tlakem, s depresí, s poruchami imunitního systému vedoucími
k mnohočetné sklerose, k revmatické artritidě a k diabetu. V současné době
roste počet studií, ze kterých vyplývá vztah mezi prevalencí výskytu rakoviny
především tlustého střeva, prostaty a prsu, ale i řady dalších maligních
onemocnění, a mírou zásobení organismu vitaminem D. Dostupnost 25(OH)D pro
lokální biosyntézu 1 a,25(OH)2D v extrarenálních buňkách je významná v prevenci
maligních onemocnění.
Z výše uvedeného je patrné, že správné stanovení
vitaminu D a jeho metabolitů z hlediska přesnosti, ale především pravdivosti,
je velkou výzvou do budoucnosti a vývoj technik, které toto správné stanovení
umožní, bude odrážet potřeby, které neustále vzrůstají vzhledem k významu
vitaminu D a jeho metabolitů. Výhodou imunoanalytických postupů je velká
kapacita stanovení a analytická citlivost v řádu pg/zkumavku. Imunoanalytické
stanovení je ale také zatíženo řadou problémů, přičemž největším je specificita
použité protilátky, která může zkříženě interagovat jak s metabolity vitaminu
D3, tak i s metabolity vitaminu D2. Poměrně vysoké zkřížené reakce mají
protilátky některých výrobců vůči 24,25(OH)2D, přičemž v cirkulaci je tento
metabolit v nanomolovém množství. Zásadní je rovněž problém se specificitou
protilátky při stanovení 1 a,25(OH)2D, jehož koncentrace je přibližně o 3 řády
nižší než koncentrace 25(OH)D. Velmi málo je diskutována specificita
používaných protilátek vůči konjugátům (sulfát, glukuronid) hydroxylovaných
metabolitů vitaminu D, přičemž v cirkulaci může být i stejné množství např.
25(OH)D3 a 25(OH)D3-3-sulfátu. Dalším problémem může být silná vazba metabolitů
vitaminu D na vitamin D vazebný protein (VDBP).
Problémem je tedy standardizace použitých imunoanalytických kitů, kdy
různé typy esejí dávají různé výsledky, na jejichž základě jsou odvozovány i
různá referenční rozmezí a přijímají se klinická rozhodnutí, která nemusí
odrážet skutečný stav zásobení populace vitaminem D.
Chromatografické postupy mají velkou výhodu ve
skutečnosti, že umožňují separaci jednotlivých odlišně hydroxylovaných a jinak
derivatizovaných (různé typy konjugátů, např. sulfáty a glukuronidy) metabolitů
vitaminu D včetně rozlišení metabolitů cholekaciferolu od metabolitů ergokalciferolu
nebo C3-epimérů vitaminu D. Nevýhodou mohou být v oblasti rutinních analýz
relativně složité přípravy vzorků před vlastní chromatografickou analýzou,
metody jsou limitovány kapacitně, a většinou je citlivost spektrofotometrické
detekce pro stanovení kalcitriolu nedostatečná.
Obecně výhodné z hlediska universálnosti,
citlivosti detekce, specificity i z časového hlediska jsou postupy založené na
kombinaci vysokoúčinného kapalinového chromatografu (HPLC) pracujícího v režimu
reversní fáze (RP-HPLC) s detekcí analytu provedenou na hmotovém detektoru
(MS), který většinou pracuje v tandemovém zapojení (MS/MS). Je zde dvojí
separační princip, tj. chromatografický a hmotově-spektrometrický založený na
poměru hmoty iontu k jeho náboji. Jednoznačnost stanovení jednotlivých
metabolitů ve spektru řady dalších metabolitů vitaminu D, použití isotopicky
značených standardů eliminujících vliv biologické matrice při kvantifikaci, a
další vývoj spojený s automatizací vede k závěru, že imunoanalytické postupy stanovení
metabolitů vitaminu D jsou nebo v blízké budoucnosti budou technikou MS
překonány, a již nyní jsou postupy HPLC-MS/MS užívány jako vhodná referenční
metoda stanovení metabolitů vitaminu D. Limitujícím faktorem je vysoká
pořizovací cena přístroje, který zatím není běžnou součástí
klinicko-biochemické laboratoře.
Tato prezentace byla podpořena projektem Molekulární genetika nádorových a kardiovaskulárních chorob (CZ.1.07/2.3.00/20.0040)
