Články a aktuality 2012 - 2018

Úvod

Mikropartikule (MP) představují heterogenní populaci sférických tělísek velikosti 0,1-1,0 μm, uvolňovaných z buněčné membrány a exprimujících specifické antigeny rodičovských buněk. Existence mikropartikulí byla poprvé popsána Wolfem v r. 1967 jako formace prokoagulačního „prachu“ kolem aktivovaných krevních destiček.

MP mohou být uvolňovány téměř všemi typy buněk při jejich aktivaci nebo apoptóze (trombocyty, makrofágy, monocyty, B a T lymfocyty, neutrofily, erytrocyty, endoteliální buňky, buňky hladkého svalstva cév, epiteliální buňky a různé nádorové buněčné linie), většina MP však pochází z krevních destiček.

MP jsou zahrnuty v řadě fyziologických procesů- hemostáza, zánět, přenos povrchových proteinů, angiogeneze nebo apoptóza. Zprostředkovávají mezibuněčnou komunikaci. Expozice fosfatidylserinu na mikropartikulích poskytuje katalytický povrch, který podporuje vazbu prokoagulačních proteinů a stimuluje koagulační reakce. Obsah fosfatidylserinu může kolísat v závislosti na buněčném původu. MP obsahující fosfatidylserin a tkáňový faktor mají nejvyšší hladinu prokoagulační aktivity, mohou se podílet na patogenezi trombózy u různých onemocnění.

Obrázek č. 1. Mikropartikule – prostředník v mezibuněčném přenosu informace

Převzato z publikace Mause, S. F. et al. Microparticles. Protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res 2010;107:1047-1057 .

Mikropartikule jsou přítomny u zdravých jedinců, ve zvýšeném množství se vyskytují u mnoha onemocnění (autoimunitní onemocnění, ateroskleróza, diabetes mellitus, malignity, infekce). Z těchto důvodů zájem o studium úlohy mikropartikulí ve fyziologii a patologii stále vzrůstá.

Výsledky měření plazmatických mikropartikulí uváděných v literatuře jsou rozdílné - důvodem je chybění standardizovaných metod, ale také variace preanalytických podmínek (použití antikoagulační látky, centrifugace, skladování). Preanalytické a analytické procedury mohou mít zásadní vliv na výsledek měření mikropartikulí a proto je standardizace preanalytických a analytických metod důležitým úkolem.

Vyšetření cirkulujících mikropartikulí - preanalytická fáze

1. Odběr krve. Během odběru krve je nutné předcházet ex vivo aktivaci krve vedoucí k neúmyslné produkci erytrocytárních nebo destičkových MP. K odběru je doporučováno použít jehlu větší velikosti, s rozměrem dostatečným k zabránění in vitro hemolýzy, aktivaci erytrocytárních a destičkových mikropartikulí, (práce uvádějí například velikost 21G). První 2-3 ml krve by k analýze neměly být použity z důvodu zabránění efektu cévního poškození způsobeného venepunkcí. Povoleno je lehké zaškrcení paže při odběru.
2. Antikoagulační látka. Jako antikoagulancia mohou být dle literatury použita: citrát sodný, EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová), CTAD (citrát-theophyllin-adenosin- dipyridamol).
3. Centrifugace. Odebraná krev by měla být ihned centrifugována. Centrifugační rychlost je zásadní pro odstranění destiček z plazmy, je preferováno použití bezdestičkové plazmy. Podmínky centrifugace jsou v literatuře stále diskutovány, bezdestičkovou plazmu lze získat například centrifugací rychlostí 1500 g po dobu 20 minut s následnou vysokorychlostní centrifugací 13000 g po dobu 2 minut. Jednoznačná doporučení dosud nejsou k dispozici.
4. Skladování. Měření mikropatikulí by mělo být provedeno preferenčně přímo z čerstvé plazmy k redukci ztráty a zachování charakteristiky MP. Dle některých prací je v případě použití čerstvě rozmražené plazmy nutná opatrná interpretace množství zvláště destičkových mikropartikulí.

Vyšetření cirkulujících mikropartikulí- analytické metody

1. Průtoková cytometrie (Flowcytometrie) je běžně užívanou metodou pro měření mikropartikulí. Je rychlá a dovoluje určení množství MP a jejich buněčný původ. Buněčný původ mikropartikulí je hodnocen pomocí fluorescenčně značených protilátek. Ačkoliv ne všechny mikropartikule nesou fosfatidylserin, fluorescenčně značený annexin V je běžně používán k měření celkového počtu MP pomocí flowcytometrie. Vazba annexinu V na mikropartikule je ovlivněna koncentrací kalcia a obsahem fosfatidylserinu. Měření počtu mikropartikulí flowcytometrií je ovlivněno nejen zmiňovanou preanalytickou fází, ale též analytickými faktory (tj. laser, protilátka, typ přístroje, kalibrace přístroje).
2. Elektronová a fluorescenční mikroskopieElektronová mikroskopie může být použita ke studiu morfologie a struktury membrány.
   Před použitím konfokální laserovou mikroskopií jsou mikropartikule barveny fluorescenčně značenými protilátkami k umožnění identifikace jednotlivých typů mikropartikulí založené na jejich antigenní expresi.
   Elektronová mikroskopie a fluorescenční konfokální mikroskopie dává informace o morfologických znacích mikropartikulí (velikost, membránová struktura, cytoskelet). Provádění těchto dvou metod vyžaduje několik hodin, a proto nejsou vhodné pro přímou detekci a kvantifikaci mikropartikulí v plazmě. Jsou užitečné pro vizualizaci mikropartikulí a validaci jiných metod měření MP.
3. Funkční metody - kvantifikace prokoagulační aktivity mikropartikulí
   A) metody závislé na přítomnosti fosfatidylserinu (annexin V zachycuje mikropartikule obsahující fosfatidylserin za přítomnosti Ca²⁺ iontů).
   Dostupné firemní sety:

• • Actichrome MP activity (American Diagnostica)
  • Zymuphen MP activity (Hyphen BioMed)
  • Procoagulant phospholipid- Proag PPL (Stago)

Závěr

Výsledky měření mikropartikulí publikované v literatuře se liší. To je jednoznačně způsobeno nejen chyběním standardizace metod vyšetření cirkulujících mikropartikulí, ale také modifikací preanalytických podmínek. Transport, časový interval před první centrifugací a podmínky centrifugace jsou tři nejdůležitější parametry, které mají největší vliv na měření MP. Informace o tom, který typ MP (tj. původ, obsah proteinů a morfologie) hraje roli v patogenezi cévních, nádorových a autoimunitních onemocnění, jsou stále limitované. Důvodem je mimo jiné i chybění standardizace metodologie v současnosti používaných analýz cirkulujících mikropartikulí.

Literatura:

1. Lacroix, R., Judicone, C., Poncelet, P., Robert, S., Arnaud, L., Sampol, J., Dignat-George, F. Impact of pre- analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: towards standardization of protokol. Journal of Thrombosis and Haemostasis, J Thromb Haemost. 2012 Mar;10(3): 437-446.
2. Mause S.F., Weber, Ch. Microparticles: Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulatin Research, 2010; 107, 1047- 1057.
3. Owens, A.P., Mackman, N. Microparticles in haemostastis and thrombosis. Circulation Research, 2011; 108: 1284-1297.
4. Rautou, P. E., Vion, A.C., Amabile, N., Chironi, G., Simon, A., Tedgiu, A., Boulanger, Ch.M. Microparticles, vascular function, and atherothrombosis. Circ. Res. 2011; 109: 593-606.
5. Thaler J., Ay, C., Pabinger, I. Clinical signifikance of circulating microparticles for velus trombembolism in cancer patients. Hämostazeologie 2011; 31: 1-6.
6. Yuana, Y., Bertina R.M., Osanto S. Pre-analytical and analytical issues in the analysis of blood microparticles. Thrombosis and Hemostasis 2011, 396- 408.